外伤、炎症、肿瘤以及先天畸形等许多因素都会造成细胞和组织的损伤，修复组织缺损并恢复其功能是临床治疗的一大难题。在通常的组织再生修复过程中，存活的健康细胞通过不断分裂和增殖，以取代死亡细胞和修复受损组织，该过程涉及组织对创伤的一系列复杂反应及多种细胞因子与周围介质的相互作用。许多生长因子在这一过程中起着非常重要的作用，包括调节细胞浸润、增殖、分化、基质的沉淀及炎症反应等。近年来有大量利用各种生长因子进行组织再生修复治疗的研究报道，但是生长因子的生物半衰期短、易灭活、生物利用度低、非持续性释放等缺点限制了其进一步应用。随着基因工程技术日新月异的发展，基因治疗为组织再生修复开辟了新的治疗途径。

基因治疗是现代分子生物学技术进步的产物。作为一种治疗手段，基因治疗可以治疗多种疾病，包括遗传性疾病、感染性疾病、癌症、心血管疾病、神经性疾病和自身免疫性疾病等。随着基因治疗技术的不断发展，基因治疗已不再局限于治疗遗传性基因缺陷性疾病等，将外源基因导入目的细胞并有效表达，从而促进组织修复是再生医学的一部分。

转化生长因子β( transforming growth factor-β，TGF-β)家族同活化素( activins)、抑制素( inhibins)、缪勒管抑制质( mullerian inhibitor substance，MIS)、骨形态发生蛋白( bone morphogenetic proteins，BMPs)等共同构成调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。TGF-β家族包括5个成员，但在哺乳动物体内，只有三种亚型，分别是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，均是分泌型蛋白，在氨基端有分泌出细胞所需要的信号肽。人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3的基因分别定位于染色体19q3、1q41和14q24，均含有7个外显子，核苷酸序列有高度同源性，所编码的前体分子C端者有9个保守的Cys。通常它们以前体蛋白的形式存在，可经蛋白酶水解激活，也可以被酸性环境、ROS和TSP-1激活。成熟的TGF-β蛋白通过二聚化的方式形成分子量为25KD的二聚体活性蛋白。

TGF-β的受体为丝氨酸/苏氨酸激酶受体，依据它们的结构和功能不同，可分为三种，即TGF-βⅠ、TGF-βⅡ和TGF-βⅢ，分子量分别是53kDa、70～85kDa、250～350kDa。其中Ⅰ、Ⅱ型受体为单次跨膜的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化Smads启动信号转导，Ⅲ型受体是一种跨膜的蛋白聚糖，单独存在时缺乏内在活性，但是对TGF-β在机体内发挥作用有重要影响。

TGF-β具有三个主要的功能:①抑制细胞增殖;②促进细胞外基质沉积;③复杂的免疫调节功能。TGF-β主要作用于表皮细胞和淋巴细胞，可以直接抵抗许多细胞因子的促有丝分裂作用。每种细胞表面的TGF-β受体不同，细胞对TGF-β的反应随着细胞的类型、生长因子的剂量和其他培养条件的改变而变化。在骨的发育和再生过程中，TGF-β1在局部产生并发挥作用，可以维持骨形成和吸收这一动态平衡。它对成骨细胞的生长起到促进还是抑制作用，主要取决于骨细胞的来源、实验条件和所用TGF-β的剂量。另外有研究表明，TGF-β1有促进软骨再生的能力，还具有促进循环内皮祖细胞分泌细胞外基质的作用; TGF-β还参与到牙胚发育过程中，调节牙胚细胞的分化、基质形成和牙胚形态发生。

1965年，Uris首先发现并报道了骨形态发生蛋白( BMPs)。目前，已知的BMPs亚型已达30多个，除了BMP-1外都属于TGF-β超家族。其中BMP-2、BMP-3、BMP-4和BMP-7的基因分别定位在20q12、14q22、14q22-q23、20q13。

BMP的受体为两类跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶型受体，分别为BMPⅠ型受体和BMPⅡ型受体。与TGF-β不同的是当BMP受体与配体结合后，是通过磷酸化激活不同的Smad蛋白( Smad1、Smad5和Smad8)介导后续信号转导。磷酸化后的Smad1/5/8与Smad4形成异聚体，并转移至核内，进而与特定靶基因序列结合(如成骨细胞中的Runx2)，启动转录过程。

BMPs可调节细胞增殖、分化及凋亡，在胚胎机体发育过程中对组织器官形态的发生及成年机体生长过程中对组织器官形态的维持起重要作用，参与胃、肠、心脏、神经、骨及软骨等多个组织和器官的形成和发育。BMP是目前发现的促成骨作用最强的生长因子之一，BMP参与骨骼的生长、发育及创伤的修复，主要表现为BMP的诱导成骨作用。BMP作用的靶细胞是未分化的、有活性的间充质细胞，它能诱导特定的、包括肌肉中和血管周围的间充质细胞，不可逆地分化为软骨和骨细胞。BMP在牙齿的发育过程中参与上皮与间充质细胞间的相互作用，起重要的信号转导作用。多种BMP在牙胚中均有表达，但BMP-4的作用被认为最为重要。研究还发现，BMP-2可以调节牙髓细胞向成牙本质细胞系的分化，促进修复性牙本质的形成，对组织工程化牙齿具有重大意义。

血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，能够调节血管以及淋巴管的生成。迄今为止，已经发现的VEGF家族成员包括VEGF-A、B、C、D、E、F和PLGF( placenta growth factor)，分子量从34至45kDa不等。人类VEGF基因定位于( 6P21. 3)，是由8个外显子和7个内含子组成，全长14 000碱基对，由于RNA的剪切拼接不同可产生数种异构体，主要的同源二聚体有VEGF ₁₂₁、VEGF ₁₆₅、VEGF _l89和VEGF ₂₀₆，分别由121、165、189和206个氨基酸残基组成。VEGF的主要受体有VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Neuropilin-1和Neuropilin-2。

关于VEGF的生物学功能，早期报道其具有增加血管通透性作用，后来发现VEGF最主要的生物学作用是可以促进动脉、静脉以及淋巴管来源的内皮细胞的生长，增强内皮细胞的生存能力，促进有丝分裂，诱导毛细血管芽新生、促进细胞移行和抑制凋亡等多种功能。

现在发现VEGF可以调节下颌骨髁状突和长骨发生时的软骨内成骨过程中的多种生物功能，其中包括协调软骨细胞、成骨的分化，破骨细胞的募集，细胞外基质的改建，血管增生和骨形成之间的关系。VEGF还可以加速神经元细胞的生长，刺激施万细胞的分裂，具有神经营养与神经保护作用。

血小板衍生生长因子( platelet-derived growth factor，PDGF)最早是在血小板中发现的，后来发现内皮细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞等都可以合成PDGF。迄今为止，已有4种PDGF多肽亚单位PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D被鉴定。这些亚单位经二硫键二聚化形成同型二聚体PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD和异二聚体PDGF-AB。人PDGF的A链分子量为16kDa，B链为14kDa，A、B链基因分别位于第7、22号染色体。

PDGF受体分PDGFRα和PDGFRβ两种。在PDGF成员中，PDGF-AA能与αα受体亚单位结合，PDGF-AB、CC可与αα、ββ受体亚单位结合，PDGF-DD能与αα、ββ受体亚单位结合，PDGF-BB则能与αα、αβ、ββ三种受体亚单位结合。PDGFR的膜外结构由若干个免疫球蛋白结构组成的酪氨酸激酶受体，可通过PI3K/AKT等途径进行信号转导。

PDGF在胚胎发育、细胞增殖、血管发生、骨形成和对组织损伤的反应等多个过程中具有许多极为重要的作用。成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞和神经胶质细胞等均有PDGFR的存在。PDGF与创伤修复过程密切相关，是创面愈合过程中较早出现的生长因子之一，参与到修复过程中组织、细胞分化和增殖过程。在成熟血管网形成的后期，PDGF通过诱导聚集血管平滑肌细胞和其他周细胞，以达到稳定新生血管的作用。PDGF通过与成骨细胞上的受体结合，对成骨细胞进行多方面的调节，刺激成骨细胞复制和促进胶原降解，从而促进骨形成。PDGF能够作用于牙周膜细胞，促进胶原和总蛋白的形成，并能降低脂多糖对牙龈成纤维细胞增殖的抑制，促进牙周组织再生。

成纤维细胞生长因子( fibroblast growth factor，FGF)普遍存在于人体的多种组织内，迄今为止，共鉴定出23个人的FGF亚型。FGFs是由150～200个氨基酸组成的多肽，相互之间的氨基酸序列有20%～50%是相同的，其中心区域有大约120个氨基酸序列存在高度的同源性( 50%～70%)。目前研究最多、最重要的是FGF-1和FGF-2，因它们的等电点分属于酸性或碱性，故FGF-1又称为酸性FGF( acidic FGF，aFGF)，FGF-2称为碱性FGF( basic FGF，bFGF)。人的FGF基因定位于染色体4q26-27，共有4万个碱基，编码序列包括3个外显子和2个内显子。哺乳动物体内，FGFs受体有四类，即FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。FGFRs包含了3个细胞外免疫球蛋白样结构域D1-D3( immunoglobulin-type domains)、1个单次跨膜区和1个细胞内酪氨酸激酶结构域。

FGFs是一组多功能蛋白，是最常见的有丝分裂原，对内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等多种中胚层和神经外胚来源的细胞有促进DNA合成和促细胞分裂作用，调控许多胚胎发育和器官形成过程。FGF-1和FGF-2是施万细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞很强的有丝分裂原，并能促进神经干细胞的增殖和分化，与脑源性神经营养因子、神经营养素-3协同作用可促进神经系统的早期分化发育，同时还具有促进损伤的中枢和周围神经再生和修复的功能。FGF-1和FGF-2的另一个重要功能是促进内皮细胞的增殖，调节内皮细胞形成管状结构，进而促进从已存在的血管上长出新生血管。FGFs在伤口愈合过程中也发挥了重要的作用，FGF-1和FGF-2促进血管发生和成纤维细胞的增殖，形成肉芽组织，早期修复创口。FGF-2在体内具有促进骨合成代谢的作用，当与合适的基质结合后能促进骨的再生。FGF-2能够增加软骨细胞对BMP-2的敏感性，促进软骨的再生。在发育和已萌出的牙齿中，成牙本质细胞、成牙骨质细胞、破骨细胞、牙髓细胞和牙周膜纤维细胞都能检测出FGF-23的表达。

胰岛素样生长因子( insulin-like growth factor，IGF)是一类与胰岛素高度同源的多肽类生长因子，具有IGF-1和IGF-2两种类型的配体，并有六种高亲和力的IGF结合蛋白( IGFBP1-6)和与之相关的IGFBP降解酶，与IGFs相结合的细胞表面受体形式有IGF1R和IGF2R两种。IGFBP被认为能够调节IGF的作用，IGFBP可以通过与IGF1R结合来抑制IGF与IGF1R的结合，降低IGF的活性，或者IGFBP通过协助转运IGF与相应受体结合并延长IGF的半衰期来增强IGF的活性。IGFs可以与IGF-1R、IGF-2R、胰岛素受体、胰岛素相关受体以及其他可能的受体。IGF1-R主要起生理性作用，IGF-1与之紧密结合程度较其与胰岛素受体结合紧密程度高。IGF-2R仅与IGF-2结合起到清除受体的作用，结合以后不激活任何细胞内信号传导通路，仅仅起到阻止IGF-2信号传导的作用。

IGF在体外是多种中胚层细胞的分裂素，它是正常胚胎发育和胎儿出生后生长所必需的。IGF被认为是软骨细胞合成代谢的主要促生长因子，正常关节软骨中IGF起着维持软骨细胞代谢稳态的作用，保持着体外蛋白多糖合成和分解的平衡。IGF-1在对正常生理活动的调节和对一些病理状态的调节(例如癌症)方面都起到了重要的作用。IGF-2被认为是多种器官早期发育的主要生长因子，而IGF-1是后期增长所需要的重要生长因子。IGF-1是成纤维细胞和骨细胞的强有力的分裂素，在骨的改建和骨量的维持方面具有重要作用，并参与到骨折的修复中。IGF-1可促进软骨细胞DNA合成、细胞分化增殖和提高细胞成熟度。IGF在神经系统的胚胎发生和分化中发挥重要作用，对成熟神经细胞的存活有支持作用。IGF与bFGF联合局部应用，可明显促进受损神经的再生和修复。动物实验研究显示全身注射IGF可以促进骨的形成。IGF-1的作用效果具有年龄相关性，在年轻生长快速的动物体内不起作用。在鼠的胫骨骨折模型中，局部注射IGF-1促进骨折愈合的作用要强于TGF-β。IGF-1还可以刺激毛囊细胞分化，参与皮肤的发育过程。

血管生成素( angiopoietin，ANG)是一种糖蛋白，分子量约为70kDa。已知存在四种亚型: ANG-1、ANG-2、ANG-3和ANG-4，另外还存在着多种与ANG密切相关的蛋白因子，包括ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANGPTL5、ANGPTL6和ANGPTL7。ANG的相应受体有Tie1和Tie2两种，ANG与相应受体结合后，受体活化并具有酪氨酸激酶活性，能够使关键底物中的酪氨酸磷酸化，来实现信号转导。

ANG对新生血管的管状分化、已存在的血管的生长和修复过程至关重要。ANG-1在调节内皮细胞与周围基质、间充质的相互作用过程中起到重要的作用，可以抑制内皮细胞凋亡促进内皮细胞生长，促进内皮细胞出芽迁移，募集管周支持细胞(周细胞及平滑肌细胞)聚集并相互作用，从而维持成熟血管的完整性及稳定性。ANG-2是ANGL的天然拮抗剂，竞争性抑制ANGL阻断Tie2受体的磷酸化激活，阻断内皮细胞与周细胞之间相互作用来改变血管壁的稳定性，导致血管重塑。Ang-2在肿瘤组织中的表达明显高于周围正常组织，且特异表达于肿瘤边缘的血管重建区，参与肿瘤新生血管的形成、延续，影响肿瘤的生长、转移。

表皮生长因子( epidermal growth factor，EGF)是最早发现的生长因子，在人类，EGF蛋白有53个氨基酸残基，编码基因定位于染色体4q25～4q27。EGF通过与细胞表面的表皮生长因子受体( EGFR)结合而发挥作用，EGFR为一个单链跨膜糖蛋白，分子量为170kDa，是酪氨酸激酶受体。配体与受体的高亲和力结合，促使受体二聚化，激发受体内在的酪氨酸激酶活性，从而启动了信号转导级联而导致多种生物化学变化，细胞内钙水平上升，增加糖酵解与蛋白质合成，增加某些基因(包括表皮生长因子受体)的表达，最终导致DNA合成和细胞增殖。

研究发现，EGF能刺激外胚层和内胚层起源的各种细胞，如上皮、神经、神经胶质、角膜、肝细胞等使其增殖分裂，刺激合成代谢的作用，EGF还对多种间质细胞包括血管内皮细胞、血管平滑细胞、成纤维细胞及软骨细胞等也有较强的作用。EGF在体内对胚胎神经干细胞的发育和分化起着重要调控作用，能调节神经内分泌系统。EGF在皮肤的发育和再生过程中的作用十分重要。EGF可以刺激角质形成细胞的增殖和迁移、促进成纤维细胞合成胶原蛋白，并参与调节毛囊形态的发生，发动毛囊的早期生长。

神经生长因子( nerve growth factor，NGF)及脑源性神经营养因子( brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神经营养因子-3( neurotrophin-3，NT-3)和神经营养因子-4/5( neurotrophin-4/5，NT-4/5)、神经营养因子-6( neurotrophin-6)均属神经营养因子范畴。由于它们的氨基酸序列高度相似，故将它们统称神经生长因子家族。

NGF由α、β与γ 3种肽链以非共价键结合，按α2βγ2的比例构成，分子量140 000左右。α亚单位的分子量为26 500，缺乏酶活性。γ亚单位的分子量为26 000，它含有共价结合的碳水化合物，并具有脂酶活性，γ亚单位可将无活性的β亚单位转化为有活性的β亚单位。β亚单位是神经生长因子的活性区，是2个由118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合的二聚体，每个单体内有3组二硫键。

神经营养因子家族的成熟活性蛋白全部为碱性蛋白质( PI＞9. 0)。人类NGF、BDNF、NT-3、NT-4分别由118、119、119和130个氨基酸组成，分子量均为14ku左右。氨基酸匹配表明，4者几乎50%的氨基酸相同，尤其是半胱氨酸残基6个绝对保守。4个可变区氨基酸数目不等，推测可能与这些因子的功能特异性及受体特异性有关。人NGF、BDNF、NT-3、NT-46个半胱氨酸形成3对二硫键。

NGF靶细胞上有3种结合部位，即膜结合部位(膜受体)、核结合部位(核受体)、与突触结合部位(突触受体)。NGF与膜受体结合后呈内在化，绝大部分与溶酶体发生作用，仅很少部分进入细胞核。这部分NGF携带着必要的生理信息，对于联系转录作用是必不可少的。NGF家族成员通过与神经元细胞表面的受体结合而起作用。通过对NGF反应细胞的放射性配基结合分析，发现存在2类受体:一种是结合配基后又很快释放的低亲和力受体( low-affinity nerve growth factor receptor，LNGFR)，另一种是结合后缓慢释放的高亲和力受体( HNGFR)，该受体是由原癌基因酪氨酸激酶( tyrosinekinase，TrK)编码的蛋白质构成，包括3种类型( TrKA、TrKB和TrKC)。

NGF在神经系统的发生和再生方面发挥重要作用，是目前被研究最多也最彻底的神经营养因子，在健康周围神经中表达很低，损伤后远侧断端处表达上调，可维持感觉神经元的存活、促进其出芽再生向远侧断端生长，还可促使感觉神经再生通过周围-中枢连接区。NGF能够促进发育中的感觉神经元和交感神经元的存活及分化，营养成熟的神经元，维持其正常的生理功能，促进神经的再生。另外，近年来的研究发现，NGF也能诱导细胞凋亡，这一现象与其受体有关。

因肿瘤、外伤、先天畸形、炎症等造成的骨缺损严重影响患者生存和生活质量。骨缺损的治疗方法有骨移植、引导骨再生和牵张成骨等，均有一定的优缺点，难以完全满足临床的需要。在骨组织的再生过程中，除了需要有相当数量的成骨前体细胞或干细胞，还需要合适的生长分子调节细胞的增殖和分化等功能。多种生长因子均有诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的作用，但是生长因子的表达往往是短暂的，通过基因转染技术使靶细胞稳定长效地分泌生长因子，维持骨局部生长因子的有效浓度是实现骨组织再生的理想方法之一。目前，利用基因治疗方法促使骨组织再生的基础研究已取得了重大的进展，骨组织再生已成为基因治疗最有应用前途的领域之一。

在骨组织的生长发育、骨生成和骨愈合过程中，有多种生长因子共同参与，协同表达，其中起重要作用的包括BMPs、FGF、TGF-β、VEGF、PDGF、IGF等。BMPs是骨生长修复的启动因子，可以诱导多种干细胞、成骨前体细胞向成骨细胞的分化; FGF可调节早期软骨内成骨过程; TGF-β可以维持骨形成和吸收的动态平衡; VEGF对骨组织的血管化起调控作用，刺激成骨细胞复制和促进胶原降解，从而促进骨形成，在骨的改建和骨量的维持方面具有重要作用，并参与到骨折的修复中。

通过基因治疗方法进行骨组织再生的实验研究近些年取得了很好的效果。在体内途径的相关研究中，可以应用基因活化基质研究骨组织再生，也可以采取直接注射法研究骨组织再生。人们从最早应用基因活化基质进行骨组织再生的研究中发现，在大鼠股骨骨缺损模型中，BMP-4和PTH1-34基因活化胶原基质组新骨的形成速度要快于BMP-4基因活化胶原基质组和PTH1-34基因活化胶原基质组。学者们利用腺病毒载体分别携带BMP-2、BMP-6、BMP-9、VEGF蛋白因子的编码基因，注射到大鼠股骨缺损、大鼠下颌骨、兔股骨缺损、兔尺骨、马跖骨等动物模型中，均可以诱导骨组织的再生。Tarkka等将腺病毒载体携带VEGF-A直接注射到大鼠股骨3cm缺损周围的肌肉中，2周后骨矿含量显著高于对照组AdlacZ组，促进新骨的形成。非目标区域的载体扩散和不良反应是 in vivo途径需要考虑的安全问题之一。事实上，在大多数情况下，骨缺损周围的肌肉组织中是有转基因的表达的。

在目前的基因治疗骨组织再生研究中，体外途径相对应用得更多，笔者所在课题组将慢病毒载体携带BMP-2基因转染的骨髓基质细胞可明显促进体内新骨形成(图18-1)。还将腺病毒AdBMP-2转染的骨髓基质细胞复合β-TCP或丝蛋白支架材料对大鼠下颌骨缺损进行修复，均取得良好的成骨效果。除了BMP以外，其他的生长因子也具有较强的促进骨组织再生的能力。Shen等在研究中发现，质粒携带IGF-1基因转染的间充质干细胞可以显著促进骨折的愈合。Guo等也发现质粒携带bFGF基因转染兔间充质干细胞复合β-TCP可以促进毛细血管的再生，加速骨缺损的愈合过程。

骨组织的再生是由多种生长因子共同参与的结果，BMP、VEGF、FGF、TGF-β等与新骨形成均有密切关系，所以多基因联合治疗在理论上比单基因治疗应具有更好的效果。学者们也验证了这一点，Franceschi等将腺病毒载体携带的BMP-2、4和7转染C3H10T1/2和ST2细胞系，8天后检测ALP活性，研究发现Ad-BMP-2、4、7联合转染时，ALP的活性均较单基因应用时提高2～4倍，提示联合应用时成骨能力提高。Peng等以反转录病毒载体携带BMP-4基因和反转录病毒载体携带VEGF基因转染肌源性干细胞，异位成骨和颅骨缺损模型中新骨形成量均较单纯反转录病毒载体BMP-4组多。作者认为VEGF通过促进血管再生促进骨组织再生，而且VEGF和BMP-4的比例对成骨效果很重要。

外伤、肿瘤、炎症、先天性畸形等均可造成软骨组织的病变或缺损，软骨细胞的低代谢性和高密度细胞外基质及软骨缺乏血液供应和神经支配的特点，限制软骨细胞向缺损区域移行，因此软骨损伤后很难进行自我修复。目前临床上多采用自体或异体软骨移植、软骨膜或骨膜移植、软骨细胞移植等方法进行修复，但均因取材局限、免疫排斥等无法取得良好的术后效果。基因强化软骨组织工程的兴起为软骨组织的再生开辟了全新的途径，应用基因转染技术可使靶细胞大量表达软骨生长所需的生长因子，有效促进软骨细胞生长和基质合成，有望成为软骨组织再生的方法之一。

软骨组织的再生是一个极其复杂的过程，从种子细胞到软骨细胞的分化过程类似胚胎发育中关节软骨形成的重现，需要多种生长因子的共同参与，是多种生长因子共同作用的结果。重要的生长因子有TGF-β、IGF-1、FGF-2、BMPs和音猬因子( sonic hedgehog，SHH)、软骨源性形态发生蛋白( cartilage-derived morphogenetic protein，CDMP)等。TGF-β可促进未分化的和分化早期的软骨细胞复制DNA，促进软骨细胞增殖，合成蛋白多糖与Ⅱ型胶原，从而诱导间充质细胞转化为软骨细胞; IGF-1可促进软骨细胞DNA合成、细胞分化增殖和提高细胞成熟度，维持软骨细胞的代谢稳态，保持着体外蛋白多糖合成和分解的平衡; FGF-2可以保持软骨细胞分化活性，合成软骨特异性细胞外基质，抑制其终末分化和钙化; BMPs可以诱导间充质细胞或骨髓基质细胞增殖分化成软骨细胞的能力，继而可分化为成熟软骨细胞，形成软骨组织; SHH参与调控细胞的增殖和凋亡，维持Ⅱ型胶原的表达; CDMP可以促进间充质干细胞聚集、浓缩，诱导间充质干细胞分化为软骨细胞，维持成人关节软骨细胞表型稳定。目前的研究多针对单一因子的作用，对于不同因子间的复合作用研究较少。

在基因治疗与组织工程结合的软骨组织再生的研究中，多种动物模型的研究结果显示软骨生长因子促进了软骨组织的再生，许多的学者采用的是 Ex Vivo途径。Mason等学者首次将基因治疗和组织工程结合应用于软骨组织的再生，他们在体外将反转录病毒载体携带的BMP-7基因转染兔骨膜间充质干细胞，然后复合聚乙醇酸支架材料，术后12周实现了膝关节软骨缺损的修复。Madry等通过pCMVhIGF-I质粒载体将IGF-1基因转入关节软骨细胞，复合聚乳酸支架材料，在体外反应器中培养10天或28天，然后将复合物植入兔膝关节软骨缺损处，28周后发现，与对照组pCMVlacZ组相比，pCMVhIGF-I组的软骨生成量显著增加。另有学者以质粒TGF-β ₁转染骨髓基质细胞复合纤维蛋白PLGA支架材料修复兔膝关节软骨缺损，12周后结果显示，缺损被完全修复，而骨髓基质细胞复合纤维蛋白PLGA支架材料组则仅仅是部分被修复。Katayama等以质粒CDMP1转染兔骨髓基质细胞修复兔膝关节软骨缺损，8周后形成的修复性软骨和正常透明软骨无异。通过 In Vivo途径的软骨组织再生也有报道。Paul等将质粒BMP-2复合胶原海绵植入兔软骨缺损处，12周后，形成的透明软骨和BMP-2复合胶原海绵组相似。Menendez等以直接注射腺病毒BMP-2和腺病毒BMP-6于马股骨软骨缺损部位，实现了在大型动物模型上的软骨组织再生。

研究人员联合采用腺病毒BMP-2和腺病毒IGF-1转染软骨膜细胞修复大鼠股骨软骨缺损，发现腺病毒BMP-2组在修复软骨缺损的同时有骨赘的形成，而腺病毒IGF-1组则无这样的副作用。虽然利用基因治疗进行软骨组织再生的研究取得了令人欣慰的进展，但是某些基因(如BMPs)在促进软骨再生的同时可能产生类似软骨内骨化、骨赘等副作用，如何避免类似副作用的产生是我们需要考虑的问题。

如何实现牙再生是口腔再生医学领域亟待解决的难题。牙再生主要包括牙体组织以及支撑牙体组织的牙周组织。本部分将分别阐述基因治疗用于牙体组织和牙周组织再生的相关研究进展。

牙体组织主要包括牙本质与富含血管和神经的牙髓形成牙本质-牙髓复合体，该复合体受到外部刺激时成牙本质细胞可以形成修复性牙本质。研究发现，牙髓暴露后直接将基因注射到牙髓断面，基因可与局部细胞整合，使细胞成为微型“生物工厂”，持续分泌生长因子，促进牙髓、牙本质的修复。因此，基因治疗近来也常被用于牙体组织的再生研究，并已取得一定进展。目前，发现的与牙体组织再生的相关因子有生长/分化因-11( growth/differentiation factor-11，GDF-11)、BMP-7、BMP-11等。

Nakashima等应用电穿孔技术将携带GDF-11基因的质粒转染体外培养的牙髓细胞，结果显示其能促进成牙本质细胞分化标记物牙本质涎蛋白( dentin sialoprotein，DSP)和牙本质基质蛋白( dentin matrix protein-1，DMP-1)表达，证实GDF-11可促进牙髓细胞向成牙本质样细胞分化。而采用超声介导微泡穿孔技术将携带GDF-11基因的质粒转染至犬牙髓断面后，形成的修复性牙本质完全覆盖了牙髓断面。将BMP7复合载体植入兔拔牙创后，发现原核表达重组BMP-7具有良好的增高牙槽嵴、促进拔牙创愈合的作用。以BMP-7充填牙髓腔，4周后近中冠髓形成不均匀的矿化和牙骨质。Nakashima M等通过超声介导转染BMP-11后在犬牙齿的牙髓断面形成大量的修复性牙本质。

牙周组织再生的基础是一组包含成纤维细胞、成牙骨质细胞、间充质细胞等在内的细胞群，即牙周膜细胞( periodontal ligament cell，PDLC)，它是具有多分化潜能的多能干细胞。其迁移、增殖、分化等一系列生物学活动的异常或随着年龄增长而造成PDLC干细胞池( the pool of stem cells)的减少会严重影响牙周组织的再生能力。因此，牙周组织的有效再生是口腔医学的一个重要目标，基因治疗是一种崭新而具有广阔前景的方法，目前，发现的与牙周组织再生的相关因子有骨保护素( osteoprotegerin，OPG)、碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast grow factor，bFGF)和PDGF。

OPG为肿瘤坏死因子受体超家族成员，属于一种可溶性的分泌型糖蛋白，是RANKL的天然诱饲受体。研究发现，牙周膜细胞表达RANKL和OPG强弱与牙槽骨破坏速度有直接关系。Jin等将人OPG-Fc皮下注射到患牙周炎鼠体内后第3～6周，鼠的牙槽骨量明显增多，证实了OPG治疗牙周病的效果。研究表明，bFGF不仅能促进牙周膜成纤维细胞的增殖，刺激细胞外基质的合成，还可刺激牙周膜新生血管网的形成，提供牙周膜细胞的血供，为牙周组织再生创造良好条件。Murakami等将bFGF局部应用于Ⅱ度根分叉病变，6周后观察结果发现，应用bFGF侧有牙周韧带生成、牙骨质沉积及新骨形成。动物实验表明，用脱钙和外源性bFGF联合修复缺损牙槽骨，与对照组比较，bFGF组有更多的牙周韧带形成、新的牙骨质沉积和骨形成，提示bFGF可以加速牙周的再生，促进牙周膜冠向生长。林鹏等设计了一种新型基因激活矩阵方式，通过嵌入壳聚糖/DNA质粒纳米编码PDGF构建一个多孔壳聚糖/胶原复合支架，结果显示在这个PDGF的复合支架内，牙周膜细胞可以保持其结构，并且2周后有牙周结缔组织样结构形成。

临床上皮肤缺损主要由烧伤、创伤及肿瘤手术切除等原因造成。虽然20世纪90年代初生长因子在创面愈合过程中得到了广泛的应用，但是局部使用重组生长因子存在半衰期短、生物利用度低、成本高、需重复给药等缺点，使得临床疗效较差。而在细胞中插入并表达外源基因的方法即通过基因治疗的方法，用于组织工程皮肤组织的构建，为皮肤创面的治疗带来了希望。

初期研究中Mizuno等学者成功运用含LacZ基因的反转录病毒转染人口腔黏膜细胞，用于皮肤的修复再生，这为组织工程皮肤的基因治疗提供了一种新的思路。皮肤T细胞募集因子( CTACK) /CCL27是参与调解角化骨主细胞从骨髓迁移到皮肤层的主要调控因子。此外，Suk Ho Bhang等将负载FGF-2因子的肝磷脂结合纤维埋入表皮缺失的小鼠全厚层皮肤中，发现在其鳞状神经上皮中的角蛋白最为丰富，这提示着FG-2的持续释放，将有助于加强皮肤的再生功能。

周围神经损伤是骨科和口腔颌面外科常见的疾病，目前的治疗手段主要是外科手术治疗和药物保守治疗。随着细胞分子水平认识的深入，基因治疗成为目前周围神经损伤修复的重要方法。

目前研究较多的神经再生相关因子有 Ad-32Ep65-Flag基因、 bex-1( brain-expressed X-linked)基因、 Wlds ( Wallerian degeneration slow)变异基因、PTEN( phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)基因、 miR-1和 miR-206基因等。涉及神经轴突、神经胶质细胞、成纤维细胞的协调行动的转录因子主要有干性因子SOX2、降钙素基因相关肽( calcitonin gene related peptide，CGRP)、垂体腺苷酸环化酶激活肽( pituitary adenylatecyclase-activating peptide，PACAP)。Sakowski等以大鼠喉返神经挤压伤为模型研究了转染Ad-32Ep65-Flag基因的初级运动神经元细胞。研究表明转染基因可以表达血管内皮生长因子，并显著提高了轴突的生长速度、加速了声带的回波运动和神经终板接触甲杓肌的百分比。由此认为该基因可通过提高血管内皮生长因子A的表达，成为治疗外周神经损伤和神经退行性疾病的新途径。

血管生长包括血管发生( vasculogenesis)、血管生成( angiogenesis)和动脉生成( arteriogenesis)三种机制，这些过程都是多因子协同调控的复杂过程，VEGF被认为是最重要的促血管生成因子，其他参与血管生长的调节因子还有FGF、PLGF、ANG-1、PDGF、HIF-1和Notch等。有学者通过切除髂外动脉远端和股动脉分支制作家兔左后肢缺血模型，术后立即将含VEGF基因的低氧诱导表达载体6HRE-pcDNA-VEGF165多点注射至患侧肌肉内，发现应用低氧诱导VEGF基因表达载体的基因治疗组胫动脉血压恢复快;动脉造影显示基因治疗组充盈早，新生血管多，可以较早地建立侧支循环。